|
诊断过敏原特异性IgE介导的过敏性疾病最常使用的检测方法是：1）体内皮肤试验，主要是皮肤点刺试验（skin prick test，SPT），2）体外特异性IgE检测。SPT因为监管的原因，要求按药品注册，国内外能使用的SPT诊断试剂会越来越少，最终可能将被体外特异性IgE取代。那体外IgE检测方法又有哪些呢？
按一次检测过敏原的个数，可以分为单通路（singleplex）、多通路 (multiplex) 和多参数（multiparameter）检测。单通路检测是指一次针对一个过敏原或一个过敏原组分的IgE抗体，现有多数产品属于这个类型，比如ImmunoCAP、符博克、纳博克、Centaur等。多通路是指一次可以检测>100种的过敏原或过敏原组分的IgE抗体，通常用于组分过敏原IgE的检测，比如ImmunoCAP ISAC和ALEX。多参数检测一般指一次可以筛查一、二十种的过敏原IgE，比如欧蒙、敏筛、欧博克。
过敏原特异性IgE检测方法很多，但核心是抗原和抗体之间的反应，抗原一般使用过敏原提取物，或纯化后的单一过敏原组分，或重组的单一过敏原分子，抗体通常为抗-IgE单克隆抗体或多克隆抗体。方法简而言之，就是血清中的IgE抗体和被固定在固相和液相中的过敏原结合，再和带标记的抗-IgE抗体反应，之后显色，读取结果。
早在1973年，第一代过敏原特异性IgE检测产品问世，采用放射免疫吸附法（radioallergosorbent test, RAST），是一种定性分析方法。RAST中采用的抗-IgE抗体是放射性碘标记的多克隆抗体，因放射性碘污染环境，2010年后RAST基本不再使用。
自动化检测平台更精确、线性范围好、重复性强、CV（coefficients of variation）低，且校准曲线（calibrationcurve）可回溯到WHO的IgE国际标准品，结果一般表示为kUA/L，“A”代表过敏原，用来区别总IgE的单位kU/L或IU/ml。因为过敏原种类太多，用过敏原标准品自校准（homologous calibration）几乎不可行，一般采用WHO的总IgE国际标准品校准过敏原特异性IgE的检测（hetrologous calibration）。
荧光免疫检测（fluorescence enzyme immunoassay,FEIA）是1989年问世的第二代特异性IgE检测方法，主要代表就是ImmunoCAP，这是一种直接的三文治法，将过1-2微克的过敏原包被在固定相上，和患者血清（40微升/测试）中的IgE反应，再加入beta-半乳糖苷酶标记的抗-IgE单克隆抗体，加底物显色，读取结果。在ImmunoCAP系统，1 kUA/L特异性IgE等于0.994 kU/L总IgE，等于2.4 ng/ml，但不是所有IgE检测系统都完成此种转换，因此不同的IgE检测系统可能使用相同的单位，但检测结果并不是完全一样。虽然没有官方指定的过敏原IgE检测金标准，但ImmunoCAP因其问世早，使用广泛，常被用来做方法学的比对。
还有一种反向或间接三文治法，也被称为免疫捕获法(capture enzyme-linked immuosorbent assay)，是将抗-IgE先包被在固定相上，和患者血清中的IgE结合，之后加入处理过的过敏原。这种免疫捕获法的典型代表是符博克、Centaur。免疫捕获法中IgE抗体先和抗-IgE特异性结合，原则上减小了IgG等其他抗体的非特异性影响。酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbentassays，ELISAs）是FEIA的一个补充，相对简单且便宜，一般在研究型实验室使用，在缺少商业化过敏原制剂时尤其有用。
2003年第三代IgE检测系统被开发出来，采用化学发光免疫检测（chemiluminescence immunoassay）和液相过敏原包被技术，代表性仪器的有西门子的Immulite、纳博克等。以纳博克为例，先进的纳米磁微粒载体和液体均相反应使得检测更快速，灵敏度更高，首结果只有50分钟，血清用量更少，只需要15微升。虽然化学发光IgE检测系统和ImmunoCAP结果一致性很好，特别是对吸入过敏原，但是因为过敏原结合的方法学不同，荧光和化学发光信号不一样，二者结果也不可以简单的互换。如前文提到的，Cenataur也是化学发光免疫检测系统，不同的是Centaur属于反相三明治法，即先包被抗-IgE，而不是过敏原。
采用免疫印迹法(immunoblot) 的欧蒙和敏筛均属于定性或半定量检测技术，或许算是第一代半产品。以欧蒙为例，首先将过敏原包被在印迹膜条上，和血清中的IgE反应后再和抗-IgE单克隆抗体结合，加底物发光后检测。免疫印迹法需要的血清量大，约1毫升，反应时间长。其结果和ImmunoCAP对比可以接受，但无法比较检测结果的一致性。
第一代多通路IgE检测系统(ImmunoCAPISAC)采用微阵列技术(microarray)，也称为蛋白质芯片法，源于基因微阵列技术，应用于IgE检测开始于2002年。产品从最初的能同时检测74种过敏原组分发展为现在的可以同时检测112种。将100 pg的过敏原包被在聚合物涂层的玻璃板上，形成直径200 微米的圆点，和血清（30微升）中的IgE反应后，再加入荧光团标记的抗IgE单抗，检测荧光的强度。ISAC的单位表示为ISU-E，检测范围是0.3-100 ISU-E，和0.3-100 kUA/L相当。
同属第一代多通路IgE检测系统的还有MeDALL(the Mechanisms for the Development of Allergies)，该系统可以同时检测170种过敏原组分，每个过敏原蛋白质的用量只有50-200 fg。此外，还有Microtest chip等。
第二代的多通路IgE检测系统采用宏阵列（macroarray）和纳米技术，有代表性的是ALEX，它将157个过敏原提取物和125个过敏原分子包被在纳米颗粒上，再将纳米颗粒放置在固定相上。ALEX需要0.5毫升的1：5稀释血清，血清稀释液中含有CCDs (cross-reactive carbohydrate determinants) 抑制剂，有效降低了CCD阳性率，增加了检测的特异性。有研究显示高达22%的对花粉、食物和蜂毒过敏的血清中含有CCDs，虽然CCDs本身并不引起临床症状，但高阳性结果极大影响诊断的准确性。天然过敏原提取物或纯化的过敏原中均有可能含有CCDs，但是重组过敏原中没有，因为蛋白质缺少翻译后糖基化的步骤。ALEX检测特异性IgE的单位是kUA/L，检测范围是0.3-50 kUA/L。除了ALEX外，第二代高通路IgE检测系统还有FABER。
总之，影响IgE检测系统的主要因素包括：1）固定相的材质，预处理及接触面积；2）过敏原或过敏原组分的纯度、活性和复杂性；3）抗-IgE的纯度和特异性；4）抗-IgE的标记物和检测方法；5）校准曲线等。
References:
World Allergy Organization Journal2020;13:100080
JACI practice 2020:doi.org/10.1016;j.jaip.2020.07.021
World J Methodol 2018;8(3):17-36
Ann Lab Med 2018;38:23-31
J Investig Allergol Clin Immunol2013;23:448-454
| 
匿名
发表于 2024-10-30 13:33:55
发表于 2022-10-7 23:06:55
站点公告
公司地址
官方微信
在线客服
